Western blot

Western blot (potocznie zwany blottingiem lub immunoblottingiem) jest techniką laboratoryjną służącą do wykrywania i identyfikacji określonych białek w mieszaninie, najczęściej w lysacie komórkowym lub w próbce tkankowej. Metoda łączy w sobie elementy elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z immunodetekcją, co umożliwia nie tylko rozdzielenie białek według masy cząsteczkowej, ale także ich selektywne oznaczenie przy użyciu antyciał.

Historia

Technika została opracowana w latach 1979–1981 przez W. M. Towbin i współpracowników, jako rozwinięcie wcześniejszych metod immunoblot i Northern blot. Początkowo stosowano ją głównie do analizy białek wirusowych, a później metoda stała się standardem w badaniach biologii molekularnej, biochemii i medycyny.

Podstawowe zasady

1. Rozdzielenie białek – próbka białkowa jest denaturowana i poddawana elektroforezie w żelu SDS‑PAGE, co powoduje rozdzielenie białek według wielkości.
2. Transfer – rozdzielone białka są przenoszone z żelu na membranę nitrocelulozową lub PVDF metodą elektroforetyczną (tzw. transfer elektroforetyczny).
3. Blokowanie – nieoznaczone miejsca na membranie są zasypane białkami (np. mleko w proszku, BSA) w celu zapobieżenia niespecyficznemu wiązaniu antyciał.
4. Detekcja – membrana jest inkubowana z pierwotnym przeciwciałem skierowanym przeciwko docelowemu białku, a następnie z przeciwciałem wtórnym znakowanym enzymem (np. HRP – peroksydaza chorych horseradish) lub fluorochromem.
5. Reakcja znakująca – w przypadku enzymatycznego znacznika dodaje się podłożą (np. chemiluminescencję) i obrazuje wynik przy pomocy aparatury detekcyjnej.

Etapy wykonania

1. Przygotowanie próbki

Komórki lub tkanki są lizaowane w buforze zawierającym detergent (najczęściej SDS), inhibitory proteaz i fosfataz. Następnie próbkę podgrzewa się w obecności reduktantów (np. DTT) i barwnika (bromofenolowy), aby zapewnić pełne denaturacje białek.

2. Elektroforeza SDS‑PAGE

Do żelu przygotowuje się gradient koncentracji akrylamidu (np. 8‑12 %). Po naładowaniu próbek oraz markerów masowych uruchamia się prąd, który rozdziela białka wzdłuż żelu.

3. Transfer na membranę

Transfer przeprowadza się w buforze transferowym (Tris‑Glycine z metanolem) przy 100 V przez 1‑2 h lub przy użyciu systemu półautomatycznego. Membrany nitrocelulozowe wiążą białka poprzez oddziaływania hydrofilowe, natomiast PVDF zapewnia wyższą trwałość i lepsze wiązanie białek hydrofobowych.

4. Blokowanie i inkubacja z antyciałami

Po transferze membrana jest blokowana przez 1 h w buforze zawierającym 5 % mleka w proszku w buforze TBS‑T. Następnie inkubuje się ją z przeciwciałem pierwotnym (zazwyczaj rozcieńczonym 1:500–1:5000) w zimnej temperaturze (4 °C) przez noc lub w temperaturze pokojowej przez 1‑2 h.

5. Detekcja

Po kilku myciach membranę inkubuje się z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z HRP lub fluorochromem. Reakcję enzymatyczną uruchamia się dodając substrat chemiluminescencyjny (np. ECL). Emisja światła jest rejestrowana przy użyciu kamery CCD lub filmu fotograficznego.

Zastosowania

• Ocena ekspresji białek w komórkach i tkankach.
• Weryfikacja działania RNAi i innych metod regulacji genów.
• Diagnostyka chorób, np. wykrywanie przeciwciał wobec HIV, HBV czy markerów nowotworowych.
• Badanie modyfikacji potranslacyjnych: fosforylacji, glikozylacji, acetylacji.
• Kontrola czystości preparatów białkowych w biotechnologii.

Korzyści i ograniczenia

Zalety: wysoką swoistość dzięki zastosowaniu przeciwciał, możliwość analizy niewielkich ilości białka, możliwość jednoczesnego badania kilku białek przy użyciu membrany z podziałem (stripowanie) lub wielu przeciwciał.

Ograniczenia: wymaga dostępności wysokiej jakości przeciwciał, proces jest czasochłonny i wymaga precyzyjnego ustawienia warunków transferu oraz bloku, a także możliwości utraty małych białek podczas transferu.

Alternatywne techniki

W zależności od potrzeb można zastosować ELISA, spektrometrię masową lub immunoprecypitację w celu bardziej ilościowej analizy białek.

Zobacz także

Białka • Elektroforeza • SDS-PAGE • Antyciała • Membrany nitrocelulozowe • Immunodetekcja • Diagnostyka laboratoryjna